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 Bedeutung von Leukämiestammzellen in autologen peripheren Blutstammzelltransplantaten von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML)

  Dr. Stefan A. Klein  Med. Klinik III an  der Johann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt a. M.

 Fördersumme   25.000,-- DM

Die allogene Transplantation von blutbildenden Stammzellen aus Knochenmark (Knochenmarktransplantation) oder peripherem Blut (periphere Blutstammzelltransplantation) ist die Therapie der Wahl zur Behandlung, ja sogar zur Heilung von Leukämien wie der Chronisch myeloischen Leukämie (CML) und akuten lymphatischen wie myeloischen Leukämien (ALL und AML). Der Erfolg der allogenen Transplantation beruht wesentlich auf der Bekämpfung der Leukämiezellen durch im Transplantat enthaltene T-Lymphozyten. Die Bekämpfung der Leukämie durch die Spender T-Lymphozyten wird als Graft versus Leukemia-Effekt (GvL-, bzw. Transplantat gegen Leukämie-Effekt) bezeichnet. Über diesen GvL-Effekt hinaus spielen allogene Spender T-Lymphozyten bei einer Reihe von weiteren Aspekten der Knochenmarktransplantation eine wichtige Rolle. So unterstützen sie das Anwachsen der blutbildenden Stammzellen und verleihen einen Schutz insbesondere gegenüber viralen Infektionen. Die Kehrseite der Medaille der allogene Spender T-Lymphozyten ist die Graft versus Host Disease (GvHD, Transplantat gegen Empfänger Erkrankung). Diese Erkrankung stellt eine Hauptkomplikation nach der allogenen Transplantation dar. Nahezu zehn Prozent der allogen transplantierten Patienten versterben an dieser Komplikation. Man geht davon aus, daß der GvL-Effekt und die GvHD auf den gleichen Mechanismen beruhen. Für den Erfolg einer allogenen Knochenmarktransplantation ist es von entscheidender Bedeutung durch das richtige Maß an Unterdrückung der T-Lymphozyten (d.h. an Immunsuppression) das Risiko der GvHD zu reduzieren und gleichzeitig einen GvL- Effekt und somit die Bekämpfung der Leukämie zuzulassen.

Die blutbildenden Zellen zur allogenen Transplantation können durch eine operative Entnahme von Knochenmark oder durch die Sammlung der blutbildenden Zellen aus dem peripheren Blut des Spenders gewonnen werden. Da die Menge dieser Stammzellen im Blut normalerweise sehr gering ist, muß vor der Sammlung der Zellen ihr Anteil im Blut deutlich erhöht werden. Dies geschieht in dem man dem Spender einen körpereigenen Wachstumsfaktor für weiße Blutkörperchen, das G-CSF (Granulozyten-Kolonien stimulierender Faktor) spritzt. Ein Teil der blutbildenden Stammzellen wird durch G-CSF in das Blut ausgeschwemmt und können mit Hilfe eines Gerätes, dem Zellseparator, aus dem Blut gewonnen werden. Die so gewonnenen Transplantate bezeichnet man als periphere Blutstammzelltransplantate (PBSCT).

Transplantate, die mit dieser Methode gewonnen werden, enthalten um ein Vielfaches mehr T-Lymphozyten als konventionelle Knochenmarktransplantate. Trotzdem ist die Rate an Spender gegen Empfänger Erkrankungen (GvHD) bei Patienten die mit peripheren Blutstammzellen transplantiert wurden nicht höher als bei Patienten, die mit Knochenmark transplantiert wurden. In manchen Veröffentlichungen ist sogar von einer niedrigeren GvHD Rate berichtet worden.

Der wesentliche Unterschied zwischen den T-Lymphozyten in den Transplantaten aus Knochenmark und peripherem Blut ist, daß T-Lymphozyten, aus peripherem Blut gesammelt werden, nachdem die Spender mit dem Medikament G-CSF behandelt sind. Die Vermutung, daß dieses Medikament einen Einfluß auf die Funktion der T-Lymphozyten hat, liegt nahe.

Es ist das Ziel dieses Projektes die Ursache bzw. die Mechanismen der veränderten T-Lymphozytenfunktion in peripheren Blutstammzelltransplantaten zu untersuchen. Die Frage nach dem Einfluß des G-CSF auf die T-Lymphozyten in Transplantaten ist kein unwesentliches Detail in der Durchführung der Transplantation. Für die gezielte Steuerung der GvHD und des GvL-Effektes ist sie von großer praktischer Bedeutung.

Es wird diskutiert, daß die Gabe von G-CSF zu einer Veränderung der Produktion von Botenstoffen (Zytokinen) des Immunsystems führt. Dieses veränderte Zytokinmuster hat sicherlich einen Einfluß auf die Funktion der T-Lymphozyten. Anhand von Mäusen konnte früher bereits gezeigt werden, daß bestimmte Botenstoffe des Immunsystems (Interleukin 4 und 10) die Entwicklung einer schweren GvHD hemmen. Gerade diese Zytokine scheinen nach der Gabe von G-CSF vermehrt gebildet zu werden.

Wir konnten mittels der Technik der intrazellulären Zytokinmessung zeigen, daß T-Lymphozyten von Stammzellspendern nach der Gabe von G-CSF in geringerem Maße die Botenstoffe Interleukin 2 und Interferon-gamma bilden. Diese Botenstoffe werden als Th1-Zytokine bezeichnet. Parallel gelang es zu zeigen, daß der Anteil der Zellen die Interleukin 4 (ein Th2-Zytokin) bilden, erhöht ist. Es besteht somit die vermutete Th1Th2 Verschiebung des Zytokinmusters.

Im Rahmen dieser Untersuchungen konnten wir darüber hinaus zeigen, daß die T-Lymphozyten unter der G-CSF Gabe sehr leicht sterben. Wir sahen eine deutlich erhöhte Rate an Zellen, die einer besonderen Form des Zelltodes, der Apoptose bzw. dem programmierten Zelltod erlagen. Dieser Zelltod trat nach der Aktivierung der Zellen auf. Wir gehen daher davon aus, daß durch die Veränderung des Zytokinmusters die Zellen weniger vor der Apoptose geschützt sind. Nach einer Transplantation würde dies bedeuten, daß T-Lymphozyten bei Kontakt mit Empfängerzellen, z.B. mit Leukämiezellen sich nicht, wie es sinnvoll wäre, vermehren, sondern sie sterben und die Leukämie nicht bekämpfen können.

In weitergehenden Experimenten soll der Mechanismus der veränderten Anfälligkeit der T-Lymphozyten für den programmierten Zelltod untersucht werden. Neben dem Zytokinmuster liegt das Schwergewicht der Untersuchungen auf Veränderungen der Expression von an der Apoptose beteiligten Genen. Ferner wird untersucht welchen Einfluß die G-CSF Gabe auf weitere Funktionen der T-Lymphozyten, wie z.B. dem Erkennen von Krankheitserrregern und von Leukämiezellen hat.

Zusammenfassend tragen diese Untersuchungen bei, den Einfluß der Herkunft bzw. der Gewinnung allogener T-Lymphozyten (Knochenmark oder peripheres Blut) für allogene Stammzelltransplantationen im Hinblick auf den GvL-Effekt, die GvHD und die Wiederherstellung der Funktion des Immunsystems nach der Transplantation zu beschreiben.

 

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  Translokation (8;21) bei akuter myeloischer Leukämie (AML) -  Etablierung von in-vivo-Modellen für AML, CML und ALL zur Erprobung molekulartherapeutischer Ansätze'

Dr. Manuel Grez,  Georg-Speyer-Haus Frankfurt am Main

 Fördersumme   15.000,-- DM   

Leukämien sind Krebserkrankungen des blutbildenden Systems im Knochenmark. Im gesunden Organismus entwickeln sich im Knochenmark aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle, der sog. Stammzelle, in mehreren Schritten alle Arten von Blutzellen (rote und weiße Blutkörperchen, Freßzellen, Granulozyten und Blutplättchen). De reifen Zellen treten dann in die Blutbahn über, wo sie spezifische Aufgaben erfüllen. Die Lebensdauer dieser reifen Blutzellen ist allerdings begrenzt, so daß sie im Knochenmark ständig aus Vorläuferzellen nachgebildet werden müssen. Dabei ist es wichtig, daß ein Gleichgewicht zwischen Ausreifung und Neubildung von Blutzellen existiert. Bei Leukämien ist dieses Gleichgewicht gestört, und es kommt zu einer starken Vermehrung von unreifen und funktionsuntüchtigen Vorläuferzellen. Ursachen hierfür sind häufig Schäden (Mutationen) am Erbgut der Vorläuferzellen. Oft handelt es sich dabei um sog. Translokationen, Übertragungen von Chromosomenbereichen zwischen nicht-homologen (unterschiedlichen) Chromosomen.

Gegenstand unseres Projektes ist die Translokation (8;21), die man bei ca. 40 % der Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) vom Typ M2 vorfindet. Bei dieser Translokation kommt es zur Fusion der Gene AML1 und ETO, die normalerweise auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind. Das so entstandene Fusionsgen AML1/ETO führt in den betroffenen Blutzellen dazu, daß diese nicht mehr zu funktionstüchtigen Zellen ausreifen (differenzieren) können. Ziel unserer Studien ist es, diese Differenzierngsblockade spezifisch aufzuheben, was langfristig zur Entwicklung einer alter-nativen Therapieform führen sollte. Bislang werden AML-Patienten einer Chemotherapie, eventuell in Kombination mit Bestrahlungen, unterzogen. Dabei soll zunächst eine komplette Krankheitsrückbil-dung (Remission) erzielt werden. Jedoch stellt diese Behandlungsform eine extreme Belastung für den Patienten dar, da nicht nur kranke, sondern auch gesunde Zellen abgetötet werden. Außerdem besteht das Risiko eines Rückfalles (Rezidivs). Von einer molekularen Therapieform erhoffen wir uns dagegen eine spezifische Bekämpfung der Leukämiezellen ohne Beeinträchtigung der gesunden Zellen, was für den Patienten eine schonendere Behandlungsform darstellen sollte.

In der Vergangenheit haben wir zunächst die Mechanismen der durch das Fusionsgen AML/ETO vermittelten Differenzierungsblockade untersucht. Dabei haben wir diejenigen Regionen identifiziert, die für transkriptionelle Repression, die die Ursache der Differenzierungsblockade darstellt, verantwortlich sind. Des Weiteren haben wir herausgefunden, welche Bereiche von AML1/ETO benötigt werden, um mit anderen Proteinen, die ebenfalls als transkriptionelle Repressoren bekannt sind, zu interagieren. Die Ergebnisse dieser Arbeiten wurden Anfang dieses Jahres in einer anerkannten wissenschaftlichen Zeitschrift veröffentlicht (Hildebrand, D. et al., J. Biol-Chem. 276: 9889 - 98995, 2001). Im Moment beschäftigen wir uns mit der Entwicklung von Proteinen, die in der Lage sind, diese Interaktionen spezifisch zu verhindern und so zu einer Aufhebung der Differenzierungs-blockade führen. Wir haben inzwischen ein Protein konstruiert, das in unserem In-Vitro-Testsystem in der Lage ist, die durch AML1/ETO vermittelte Repression spezifisch aufzuheben. Zur Zeit wird die Wirkung dieses Proteins in t(8;21)-Leukämiezellen untersucht. Darüber hinaus versuchen wir, dieses Protein möglichst so zu verkleinern, daß es als zellgängiges Peptid in Zellen eingeschleust werden kann.

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